一般生物制药的首要流程如下：1.上游阶段 1.1 意图基因的制备 意图工程的首要意图是使优秀性状相关的基因集合在同一生物体中,创造出具有高度使用价 值的新物种. 为此有必要从现有生物集体中,依据需求别离出用于克隆的次类基因,这样的基因 称之为意图基因. 基因工程中取得的意图基因首要用于: (1).研讨该基因,剖析其结构,功用和 表达的调空机制 (2).和正常基因比较,找出基因的反常点,探究疾病产生的分子生物学根底. (3).研讨生物种系的进化 (4).树立基因疗法,将正常基因引进患者体内,医治遗传性疾病(5).大 量表达某种基因,出产出需求的蛋白和多肽 (6).对某些基因进行改组,改进动植物品种. 不同基因组类型的基因组巨细不同,基因组和基因摆放也各不相同,因而,别离意图基因应采 用不同的途径和办法 1.1.1 构建cDNA基因文库别离法 cDNA文库是以真核细胞中别离纯化出一切的mRNA,在以mRNA为模板组成cDNA与恰当 的载体重组转入宿主细胞,这样树立起来的cDNA重组分子集合体称为cDNA文库.而cDNA 文库中刺进片段的总和可代表某一种生物悉数的mRNA序列. 1.1.1.1 cDNA 文库的构建 构建cDNA文库首要包含以下进程: (1).细胞总RNA的制备及mRNA的别离 (2).以mRNA 为模板,组成cDNA第一条链 (3).双链cDNA的组成,而将mRNA—DNA 杂交分子转变为双 链cDNA分子 CDNA与载体的衔接和噬菌体颗粒的包装及感染或质粒的转化等1.1.1.2 cDNA 克隆的优越性 自20 世纪70 年代初说创cDNA克隆面世以来,以选用构建和挑选cDNA文库的办法克隆了 许多意图基因的cDN**段.在基因工程操作中,也长以cDNA为探针从基因文库中别离相应的 基因克隆.因而, cDNA 克隆常常以基因别离和结构剖析的着手点,在分子生物学研讨和基因 工程使用等方面具有非常重要的含义. 1.1.2 构建基因组文库别离法 1.1.2.1 基因组文库的概念 将某种生物的基因组 DNA 切开成必定巨细的片段,别离与适合的载体重组后导入宿主细胞, 这些重组分子中刺进片段的总和可代表该生物悉数基因组序列.这种经过重组,克隆办法保存 在宿主细胞中的各种DNA重组分子的集合体称为基因组文库. 1.1.2.2 基因组文库的巨细 克隆片段的均匀巨细/bp 基因组的巨细/bp 210^6(细菌) 210^7（线（动物） LN SJ LN SJ LN SJ 510^3 400 1831 4000 18418 600000 2736110 1010^3 200 919 2000 9208 300000 1381550 2010^3 100 458 1000 4603 150000 690774 4010^3 50 278 500 2300 75000 345386 一个抱负的基因组文库因该是在克隆集体中包含完好基因组的一切 DNA 序列.这就要求在 打断基因组 DNA 时尽或许做到随机切开,实际上,不管选用什么办法的不能到达理论上的切 割.应此构建的基因组文库应包含的克隆子数理论值和经验值之间相差比较大.几类基因组文 库的巨细见下表: 1.1.2.3构建基因组文库的类型 经过克隆,重组办法构建的基因组文库首要有： (1)构建λ 噬菌体基因组文库；（2）构建考斯质粒基因组文库 构建YAC基因组文库 1.1.3 直接别离法 1.1.3.1 约束性核酸内切酶酶切别离法 约束性核酸内切酶酶切别离法适于简略基因组中别离意图基因.质粒和病毒等 DNA 分子小 的只需几千碱基,大的也不超越几万碱基,编码的基因较少,取得的意图基因办法比较简略. 1.1.3.2 基因别离的物理化学法 这是基因工程在展开初期所用的办法,某些生物的rDNA基因最早都是使用该法别离取得的, 但现在很少选用.次办法首要有：密度梯度离心法、单链酶解法和分子杂交法等.1.1.3.3 体免疫法别离编码蛋白的基因双抗体免疫法别离编码蛋白的基因适于某一真核细胞的蛋白质已被别离纯化,且足以产生抗 1.1.3.4使用酶促反转录发直接从特定mRNA别离基因 酶促反转录首要用于组成分子质量较大,转录产品mRNA易别离意图基因. 意图基因的mRNA为模板 逆转录酶 cDNA DNA聚合酶双链 双链cDN**段 与适合载体重组并转入受体菌 cDNA克隆 1.2 意图基因的别离 经过恰当的办法构建上一个完好的基因组 DNA 文库或 CDNA 文库,意味着包含意图基因在 内的一切基因都得以克隆, 但并不等于完成了意图基因的别离. 因为在基因文库中,不论是 CDNA文库仍是基因组文库,含意图基因的克隆子都只是数以万计的克隆子中的一个,其间究 竟哪个克隆子含有咱们所需求的意图基因序列还不清楚.因而,还需求下一个进程要进行的就 是意图基因的别离,首要办法有： （1）意图基因的功用克隆 （2）序列克隆法 （3）使用差示剖析法别离意图基因克隆 （4）功用结合法挑选意图基因 （5）DNA刺进诱变法别离意图基因 （6）使用基因定位克隆技能别离挑选意图基因 （7）基因的定位侯选克隆法 （8）染色体显微切开与微克隆法 （9）依据生物大分子内的相互效果别离意图的CDNA克隆 （10）挑选意图基因片段的不同杂交及减法杂交技能 1.3 基因克隆载体 载体是带着意图基因的 DN**段进入受体细胞进行扩增和表达的东西.常用的载体是经过改 造的细菌质粒,噬菌体,黏粒和病毒 1.3.1 质粒克隆载体 质粒是细菌染色体外的双链环状的能自我仿制的小分子DNA,其对细胞本身的成长繁衍不是 必需的,但可以赋予细菌必定的类型,如耐热型等. 与构建克隆载体相关的质粒性质有： （2）质粒的不（3）相容性 （3）质粒的接合性 （4）质粒作为基因工程载体需求具有的条件：作为基因工程载体的质粒都是经过人工改造 过的质粒,具有以下特色： 带有双挑选符号1.3.2 病毒（噬菌体）克隆载体 病毒首要由DNA（或RNA）和外壳蛋白组成,经包装后成为病毒颗粒.经过感染,病毒颗粒进 入宿主细胞,使用宿主细胞的组成体系进行 DNA(或 RNA)仿制的壳蛋白质的组成,完成病毒 颗粒的增殖.人们使用这些性质构建了一小列别离适用于不同生物的病毒克隆载体.经过此种 办法构建成的基因克隆载体首要有： 噬菌体克隆载体cosmid克隆技能（黏粒） （2）Μ13 噬菌体克隆载体 aMV克隆载体（4）烟草花叶病毒（ TMV）载体克隆 （5）SVCO 克隆载体 （6）反转录病毒克隆载体 （7）腺病毒克隆载体 （8）痘苗病毒克隆载体 （9）杆状病毒表达克隆载体 1.3.3 其他类型的克隆载体 （1）染色体定位整合克隆载体 （2）人工染色体克隆载体 特别用处克隆载体：如启动子探针型,（4）诱导型,（5） 反义表达安排特异表达, 排泄型表达,（7）双启动子,（8） 串族启动子和含增强子表达克隆载体等等 1.4 意图基因和载体的衔接（重组） 意图基因和载体衔接前要先用同一种约束酶将意图基因和载体切开成黏性端或平端,也可以 用物理办法切开后再用酶补成平端 体外衔接是基因工程的重要环节,体外衔接要削减载体的本身环化,进步重但子阳性率.首要 的衔接办法有：黏性结尾衔接、平端衔接、定向刺进和同源多聚尾. 1.5 重组体导入受体细胞 外源意图基因与载体在体外衔接重组后构成重组的DNA分子.该重组DNA分子有必要导入适 宜的受体细胞在中才干使外源意图基因得以很多扩增或表达.跟着基因工程的展开,从低一级的 原核细胞,到简略的真核细胞,进一步到达结构杂乱的高级动,植物细胞都可以作为基因工程 的受体细胞.挑选适合的受体细胞已经成为重组基因高效克隆或表达的根本前提之一 1.5.1 受体细胞的挑选要求 意图基因取得后,有必要在适合的宿主细胞中才干进行表达,才干取得意图产品.应此,宿主细胞 有必要满意:简单取得较高浓度的细胞;能使用易得廉价的资料;不致病、不产生内毒素;发热量 低,需氧低,恰当的发酵温度和细胞形状;简单进行代谢调控;简单进行DNA重组技能操作技能; 产品的产值、产率高,产品简单提取纯化. 1.5.2 受体细胞的类型 人们经过研讨,依据需求取得了必定的意图产品,而意图基因能否的到有用的表达,要害在与 受体细胞的挑选. 1.5.2.1 原核生物细胞 因为原核生物作为基因工程受体具有其他生物所没有的长处,并且人们对其遗传布景清楚,所 以前期展开的基因工程操作,都是以原核生物为受体细胞.现在研讨比较多的有:大肠杆菌、枯 草芽孢杆菌、链霉菌等. 1.5.2.2 真核生物细胞 因为真核生物的细胞结构、基因组成和基因表达较为杂乱,适用于原核生物的转基因办法大 大都难以有用地用于真核生物.近年来经过探究,发现它可以对表达的蛋白质进行翻译后加工 进程,有利于坚持天然结构和生物活性.并用这些办法有用的取得了转基因真核生物.研讨较 多的有:酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等等. 1.5.3 重组子的挑选 在重组DNA分子的转化、转染和转导进程中,并非一切的的受体细胞 都能被导入重组DNA 分子.一般仅有少量重组 DNA 分子能进入受体细胞,一起也只需极少量的受体细胞在吸纳重 组DNA分子之后能杰出增殖.因而,怎么将被转化细胞从很多受体菌细胞中开始挑选出来,然 后进一步检测到含有等待重组DNA分子的克隆子将直接关系到基因克隆和工程操作红极为 重要的环节. 重组子的挑选可以依据载体的类型、受体细胞品种以及外源DNA分子导入受体细胞的手法 等选用不同的办法,一般包含以方面: (1).遗传直接挑选法; (2),核算分子杂交检测法; (3)依赖于重组子结构特征剖析的挑选法; (4)免疫化学检测法; (5)转译挑选法; (6)亚克隆法; (7)刺进失活法; (8)电子显微镜作图检测法; (9)基因表达产品剖析法; (10)DNA 序列剖析法. 1.6、外源基因的表达 基因工程技能的中心是基因表达技能.迄今为止,已构建了多种基因表达体系,包含原核生物 和真核生物基因表达体系,不同的表达体系具有各自的特色. 1.6.1 基因表达的机制（进程） 1.6.1.1 外源基因的开始转录 外源基因在宿主细胞中的有用表达是基因工程的中心问题,而外源基因的开始转录又是基因 表达的要害. 1.6.1.2 mRNA 的延伸与安稳性 外源基因开始转录后,坚持mRNA的有用延伸、停止及安稳存在是外源基因有用表达的要害. mRNA 的安稳性直接导致决议翻译产品的多少, 对原核细胞来说, 最佳的办法是挑选一个 RNase 缺失受体前.对真核细胞来说则需考虑添加 mRNA 的正确加工,进步老练 mRNA 定性.1.6.1.3 外源基因mRNA的有用翻译 翻译是 mRNA 辅导多肽链生成的进程,翻译的开始是多种因子协同效果的进程,其间包含 mRNA,16SrRNA,fMet-tRNA 之间的碱基配对,还有 mRNA 序列上的停止暗码对正确翻译的 功率有很大影响. 1.6.1.4 表达蛋白在细胞中的安稳性 外源基因的表达产品能否在宿主细胞中安稳堆集而不被内源蛋白水解酶所水解是基因有用 表达的一个重要因素,因而,为了防止此现象的产生可从以下几个方面考虑： （一）构建交融蛋白表达体系; （二）构建分子体蛋白表达体系; （三）构建包容体表达体系; （四）挑选蛋白水解酶基因缺点型的受体体系. 1.6.1.5 意图基因缄默沉静 基因缄默沉静是导致外源基因不能正常表达的重要因素.它的效果机制首要有三种：方位效应的 基因缄默沉静、转录水平的基因缄默沉静和转录后水平的基因缄默沉静.基因缄默沉静现象首要表现在转基因 动物和植物中. 意图基因缄默沉静是在核酸水平上DNA与DNA,DNA与RNA,RNA与RNA相互效果的成果.由 于重复序列或同源系列是基因缄默沉静的一般原因之一,因而在构建表达载体时,应尽或许防止与 内源序列具有较高的同源性.此外,可以经过挑选甲几基化酶活性较弱的受体细胞或以化学物 质处理受体细胞按捺甲基化效果. 1.6.2 基因表达的调控元件 经过研讨发现首要的基因表达调控元件有：启动子、增强子、停止子、衰减子、绝缘子和反 义子 1.6.3 外源基因表达体系 外源基因表达体系泛指意图基因与表达载体重组后,导入适合的受体细胞,并能在其间有用的 表达,产生意图基因产品（意图蛋白）.由此可知,外源基因表达体系由基因表达载体和相应的 受体细胞两部分组成.基因表达体系有原核生物表达体系和真核生物表达体系.现在,使用较 多的是原核生物表达体系,因其遗传布景清楚,繁衍快,表达率高级特色.近年来,真核生物基因 表达体系展开很快,因其可以对表达的蛋白质进行翻译后加工进程,有利于坚持天然结构和生 物活性等长处.现在首要使用的表达体系有：大肠杆菌基因表达体系、芽孢杆菌表达体系、 链霉菌表达体系、蓝藻表达体系、酵母表达体系、哺乳动物细胞基因表达体系、植物细胞基 因表达体系；还有最新研讨的两个新的表达体系[3]：巴斯德毕赤酵母表达体系和动物乳腺 生物反响器——全新的出产形式. 2、下流阶段 基因工程只需的进程要害在于上游阶段,因它可以取得有用的工程菌,但下流纯化阶段也必不 可少.因而为了取得合格的意图产品,有必要树立相应的医药生物技能产品的别离纯化工艺. 2.1、基因工程菌发酵： 杰出的发酵工艺对表达外源蛋白至关重要,直接影响下流纯化工艺,形象到产品的质量和出产 本钱,决议产品在市场上的竞争力.现在,基因工程菌培育常用办法有：补料分批培育、接连培 养、透析培育、固定培育.近年来,生物药品已进入生物技能年代,对基因工程菌的培育设备要 求非常严厉,首要选用新式自动化发酵罐. 2.2、别离纯化的根本进程： 别离纯化是基因工程药物出产中极其重要的 一环,这是因为工程菌经过大规模培育后,产生的 有用成分含量低,杂质含量高；别的因为基因工 程药物是从转化细胞,而不是从正常细胞出产的, 所以对产品的纯度要求也高于传统产品,首要的 进程如右表：[4] 2.2.1、树立别离纯化工艺依据 首要依据：（1）含意图产品的开始物料特色; （2）物猜中杂志的品种和性质; （3）意图产品特性; （4）产品质量的要求. 2.2.2、挑选别离纯化办法的依据： 首要依据： 依据别离纯化工艺的要求来挑选.2.2.3、常用的别离纯化办法（见下表）[5] 办法 意图 离心/过滤 去除细胞、细胞碎片、颗粒性杂质(如病毒) 阴离子交流层析 去除杂质蛋白、脂质、DNA和病毒等 阳离子交流层析 去除牛血清蛋白或转铁蛋白等 超滤 去除沉淀物及病毒 疏水层析 去除剩余的杂蛋白 凝胶过滤 与多聚体别离 0.22μ 20世纪 80 年代初第一种基因工程产品——人胰岛素投放市场以来,以基因工程药物为主 导的基因工程使用已成为全球展开最快的工业之一.跟着生物技能的快速展开,基因工程药物 将具有越来越宽广的展开远景.基因工程药物首要包含细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核 苷酸药物等,它对防备和医治人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种感染病、糖尿病、类 风湿疾病等有重要效果. 3.1、基因工程激素类药物 激素是一类由生物体内排泄腺或特异性细胞产生的微量有机物,经过体液或细胞外液运送到 特定的效果部位,能引起特别的生理效应.基因工程的激素类首要指经过基因工程办法组成的 蛋白多肽类激素.现在被同意上市的激素类药物有胰岛素、人成长激素、人促卵泡激素等. 3.2、基因工程细胞因子类药物 细胞因子是由细胞排泄的可以调理物有机体生理功用,参加细胞的增殖,分解和凋亡的小分子 多肽类物质.现在被同意上市的产品有十多种.首要有：干扰素（IFN）、集落刺激因子（CSF）、 白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF）,趋化因子和成长因子（GF）等.它们的生物学功 能首要表现为：调理免疫应对、抗病毒、抗肿瘤、调理机体造血功用和促进炎症反响等. 3.3、基因工程疫苗： 直接使用微生物制备疫苗来医治疾病取得了巨大的成果,但因为各种感染病在世界范围内广 泛存在,并不断有新的致病微生物被发现,它们对人类的健康形成巨大要挟. 使用基因工程方 法制备疫苗对操控感染病的复发和医治新的感染病有重要含义.现在研讨的基因工程疫苗包 括：痢疾菌苗、霍乱菌苗、结核菌苗、流感菌苗、狂犬病疫苗、疟疾疫苗、口蹄疫疫苗. 3.4 特别基因工程药物—防护素 防护素是一类在生物界广泛存在的、富含半胱氨酸,具有微生物和一些恶性细胞抗性的小分 子短肽.它的抗性谱非常广泛,现在以发现它不但对细菌、真菌和被膜病毒(如爱滋病病毒)有 广泛的毒杀效应,对某些恶性肿瘤细胞也有毒杀效果.最近, 对一些长时间存活的爱滋病感染者 的研讨发现,他们体内的爱滋病按捺因子便是一类防护素.这一研讨发现给人们打败爱滋病带 来期望. 基因工程研讨展开远景基因工程面世以来短短的二十几年,显现出了巨大的生机,使传统的出产方式和工业结构产生 了改变.特别是在医药行业,使用人工的办法组成了许多有用的药物及人体器官等,取得了很 大的经济效益.往后,基因工程将要点展开基因组学、基因工程药物、动植物生物反响器和环 保等方面的研讨.经过这方面的研讨、开发,对人类的日子、生存环境从根本上优化做出巨大 的奉献.因而,咱们信任基因工程的远景将是愈加灿烂辉煌.